2分钟科普“营口92麻将为啥场场输(怎么提高胜率)

熟悉规则：首先，你需要熟悉微乐麻将的游戏规则 ，

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包括如何和牌、胡牌 、
、碰、等。只有了解了规则
，才能更好地制定策略 。 克制下家：在麻将桌上，克制下家是一个重要的策略
。作为上家 ，你可以通过控制打出的牌来影响下家的牌局
，从而增加自己赢牌的机会。 灵活应变：在麻将比赛中，情况会不断发生变化 。你需要根据手中的牌和牌桌上的情况来灵活调整策略
。比如 ，当手中的牌型不好时
，可以考虑改变打法，选择更容易和牌的方式。 记牌和算牌：记牌和算牌是麻将高手的必备技能 。通过记住已经打出的牌和剩余的牌 ，你可以更好地接下来的牌局走向
，从而做出更明智的决策
。 保持冷静：在麻将比赛中，保持冷静和理智非常重要。不要因为一时的胜负而影响情绪 ，导致做出错误的决策 。要时刻保持清醒的头脑，分析牌局
，做出佳的选择
。  
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请注意，虽然微乐麻将自建房胜负规律策略可以提高你的赢牌机会 ，但麻将仍然是一种博弈游戏
，存在一定的运气成分。因此，即使你采用了这些策略 ，也不能保证每次都能胜牌 。重要的是享受游戏过程
，保持积极的心态。
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全基因组DNA甲基化实验怎么做？从技术原理、建库测序流程 、信息分析流程和研究套路等四方面详细介绍
。

表观修饰不需要改变 DNA 序列便能实现对性状的改变，表观修饰的改变与基因功能乃至细胞状态
、发育、衰老 、疾病等存在重要的关联。在众多的表观遗传修饰中 ，最为重要且研究最为广泛的修饰之一是 DNA 甲基化
，而全基因组甲基化测序（WGBS-seq）无疑是最有效的研究手段 。

全基因组甲基化测序利用重亚硫酸盐能够将未甲基化的胞嘧啶（C）转化为胸腺嘧啶 （T）的特性，将基因组用重亚硫酸盐处理后测序 ，即可根据单个 C 位点上未转化为 C 未转化为 T 的 reads 数目与所有覆盖的 reads 数目的比例
，计算得到甲基化率
。该技术对于全面研究胚胎发育
、衰老机制、疾病发生发展的表观遗传机制，以及筛选疾病相关的表观遗传学标记位点具有重要的应用价值。

全基因组甲基化测序原理示意图入下：

样品检测——样品打断 ——文库构建——BS处理——文库质检

（一）样品检测

对DNA样品的检测主要包括2种方法：

（1）琼脂糖凝胶电泳分析DNA降解程度以及是否有污染 ，检测具有明显的主带，且条带清晰；

Qubit 2.0对DNA浓度进行精确定量
，DNA检测总量不低于1ug 。

（二）文库构建

样本检测合格后，使用Bioruptor系统将1?g样品基因组DNA与未甲基化的lambda DNA混合 ，然后将其片段化
，平均大小约为250bp
。片段化后，纯化的随机片段化DNA随后用T4 DNA聚合酶 ，Klenow片段和T4多核苷酸激酶的混合物进行修复
，钝化和磷酸化末端。随后使用Klenow片段（3'-5'exo-）对钝的DNA片段进行3'腺苷酸化，然后与连接5'-甲基胞嘧啶而不是使用T4 DNA连接酶的胞嘧啶连接的衔接子进行连接 。完成每个步骤后 ，使用磁珠纯化DNA
。之后
，根据说明使用ZYMO EZ DNA甲基化金试剂盒将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。最后，用JumpStart Taq DNA聚合酶进行PCR扩增 ，再使用磁珠对PCR产物进行纯化获得最终文库 。

（三）文库质检

文库构建完成后
，先使用Qubit2.0进行初步定量，稀释文库至1ng/ul ，随后使用Agilent 2100对文库的insert size进行检测，insert size符合预期后
，使用qPCR方法对文库的有效浓度进行准确定量（文库有效浓度> 2nM），以保证文库质量
。

（四）上机测序

文库检测合格后 ，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后在illumina Nova平台测序
，测序策略为PE150。

（一）原始下机数据质控

原始下机数据为FASTQ格式，是高通量测序的标准格式 。FASTQ文件每四行为一个单位 ，包含一条测序序列（read）的信息。该单位第一行为read的ID
，一般以@符号开头；第二行为测序的序列，也就是reads的序列；第三行一般是一个+号 ，或者与第一行的信息相同；第四行是碱基质量值
，是对第二行序列的碱基的准确性的描述，一个碱基会对应一个碱基质量值 ，所以这一行和第二行的长度相同
。以下为一条read信息的示例：

原始下机数据包含建库时引进的接头序列以及质量过低的碱基
，这些因素会导致后续比对到基因组的reads较少，从而导致得到的信息较少 ，因此需要进行过滤。利用trim_galore软件对原始数据进行去除接头序列及低质量碱基等质控步骤 。

（二）序列比对

经过质控的reads需要根据与参考基因组的序列相似度比对到参考基因组上
。相比于常规基因组及转录组测序，WGBS测序方法产生的数据的特点决定其在比对时存在三大困难：

（1）DNA片段正链和负链经过重亚硫酸盐转化后将不再反向互补
，再经过PCR，便会产生四条不同的序列 ，这将大大增加比对时的计算量。

（2）经过重亚硫酸盐转化后
，DNA序列大部分C碱基被转化成T碱基，因此序列含大量T而缺乏C；经过PCR后 ，产生的互补链则含有大量A而缺乏G 。这样便导致序列的复杂度降低（即序列的组成特征更单一）
，从而增加比对的难度
。

（3）C和T的比对是不对称的。经过重亚硫酸盐转化后，序列中非甲基化的C碱基（占大部分）被转化为T ，这将导致测序序列与参考基因组不匹配
，T既可能应该比对到T上，有可能应该比对到C上；而C则只能比对到C上 。这也增加了比对的难度
。

利用BSMAP软件进行比对。BSMAP进行比对时 ，先以参考基因组上C碱基的位置作为指导
，将reads中对应参考基因组C碱基位置的T标记为C，其他T保持不变 ，从而使reads可以直接比对到参考基因组 。

（三）甲基化水平计算

甲基化水平可根据未转化为 T 的 C 与转化为 T 的 C 的 reads 的比例计算得到，即：

Beta-value = C-reads / (C-reads + T-reads) * 100%

其中
，Beta-value 即为该胞嘧啶的甲基化水平，C-reads 为覆盖该位点的支持甲基化的reads 数目（测得该位点为 C 的 reads） ，T-reads 为覆盖该位点的不支持甲基化的 reads 数目（测得该位点为 T 的 reads）
。 计算原理示意图如下：

利用BSMAP统计甲基化水平。

（四）差异甲基化区域（DMR）鉴定及统计

DMR检测使用权威期刊发表的metilene软件 。该软件先将基因组进行预分段
，以排除较长序列中不包含CG位点的片段。随后，利用二元分隔算法 ，递归缩小检测范围
，以搜索得到组间累积平均甲基化差异最大的区域，作为可能的DMR；最后 ，结合双重统计学检验（MWU-test和2D KS-test）
，得到准确的DMR
。检测原理如下图所示：

本分析检测DMR的标准如下：

（1）区域平均甲基化差异不小于0.1；

（2）CpG位点数不少于5个；

（3）区域长度不小于50 bp；

（4）甲基化水平差异统计检验的校正P值小于0.05；

（5）2D KS-test检验P值小于0.05。

（五）信息分析流程示意图

DNA甲基化组学研究的核心内容在于对DNA甲基化数据的挖掘 。DNA甲基化一般遵循三个步骤进行数据挖掘
。

首先，进行整体全基因组甲基化变化的分析 ，包括平均甲基化水平变化 、甲基化水平分布变化、降维分析
、聚类分析、相关性分析等。

其次
，进行甲基化差异水平分析，筛选具体差异基因 ，包括DMC/DMR/DMG鉴定 、DMC/DMR在基因组元件上的分布
、DMC/DMR的TF结合分析、时序甲基化数据的分析策略 、DMG的功能分析等 。

最后，将甲基化组学&转录组学关联分析
，包括Meta genes整体关联
、DMG-DEG对应关联、网络关联等
。

Whole-Genome Bisulfite Sequencing of Two Distinct Interconvertible DNA Methylomes of Mouse Embryonic Stem Cells. 两种状态的小鼠胚胎干细胞的甲基化组学研究

1 、背景

小鼠胚胎干细胞一般生长在含有血清的基质中，被称作血清干细胞(serum ESCs)；加两种激酶抑制因子使胚胎干细胞在无血清的情况下更能保持多能性的基态 ，这种干细胞称为2i干细胞(2i ESCs)；这两种状态的胚胎干细胞可以互相转化。以前这方面的甲基化研究大多基于质谱
，覆盖度和研究结果有限，尚缺乏2i胚胎干细胞的甲基化组学研究 。

2
、方法

利用全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS） ，对这两种可互相转换的小鼠胚胎干细胞进行甲基化组学研究

3、结论

全面准确的检测了两种小鼠胚胎干细胞的DNA甲基化修饰并进行了系统的比较；同serum ESCs相比
，雄性2iESCs全局低甲基化；在血清中，雌性ESCs跟雄性2i ESCs类似呈现全局低甲基化 ，而在2i ESCs状态下
，甲基化水平会进一步降低
。

以上就是关于全基因组甲基化测序实验流程和分析思路的介绍。

参考文献：

[1] Ashburner, M. and C. A. Ball, et al. Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium. Nat Genet, 2000, 25 (1): 25-9.

[2] Dirk Schübeler. Function and information content of DNA methylation. Nature, 2015, 517: 321–326.

[3] Frank Jühling et al. metilene: Fast and sensitive calling of differentially methylated regions from bisulfite sequencing data. Genome Research, 2016, 26: 256-262.

[4] Kanehisa M, Goto S. KEGG: kyoto encyclopedia of genes and genomes. Nucleic acids research, 2000,28(1): 27-30.

[5] Tadafumi Kato Kazuya Iwamoto. Comprehensive DNA methylation and hydroxymethylation analysis in the human brain and its implication in mental disorders. Neuropharmacology, 2014, 80: 133-139.

[6] Xiaojing Yang et al. Gene Body Methylation Can Alter Gene Expression and Is a Therapeutic Target in Cancer. Cancer Cell 26, 577–590.

[7] Yuanxin Xi et al. BSMAP: whole genome bisulfite sequence MAPping program. BMC Bioinformatics, 2009, 10:232.

[8] Gao F, et al. De novo DNA methylation during monkey pre-implantation embryogenesis. Cell Res. 2017 Apr;27(4):526-539. pii: cr201725.

大肠杆菌基因组提取

在实验开始，首先对实验的一些必须步骤（注：在几乎每一次小实验都会使用到的试验方法）做一定的解释 。避免在写实验报告的过程中太过混乱！并且这些过程并不是每一位同学都参与了的 ，故在本实验报告的开篇写出
。

（一）制备1%的琼脂糖凝胶

称取1g琼脂糖
，放入锥形瓶中，加入100 mL的1 × TAE缓冲液 ，在微波炉中加热。完全融化后，取出摇匀 。

（二）胶板的制备

1. 用橡皮膏将胶板的两端边缘封闭好。

2. 将胶板放在水平处
，放好样品梳子
。

3. 将冷却到60℃左右的琼脂糖凝胶缓慢倒入胶板中，注意不要产生气泡。胶的厚度在3-5mm之间 。

4. 待胶凝固后 ，取出梳子
，取下橡皮膏，放入电泳槽内（注意：梳子的方向靠近负极）
。

5. 向电泳槽中加入1 × TAE缓冲液 ，缓冲液要浸没凝胶。

（三）加样

1. 在样品中加入适量的10 ×上样缓冲液
，使缓冲液的终浓度为1× 。

2. 用微量移液器将已加入缓冲液的样品加入上样孔中
。记录加样的顺序和加样量。（注意：加样的过程中不要让样品溢出上样孔）

（四）电泳

1. 接通电泳槽与电泳仪的电源（注意DNA片段是从负极向正极移动） 。DNA的迁移速度与电压成正比
。最高电压不超过5V/cm。

2. 当溴酚蓝染料移动到凝胶的2/3处时，停止电泳 。

（五）染色

将电泳后的凝胶浸入溴化乙锭染色液中（带手套操作）
。

（六）观察实验结果

在紫外灯（360 nm或254 nm）下观察染色后的凝胶 ，DNA处显出橘红色的荧光条带。

实验一 大肠杆菌基因组提取

实验目的

1.学习并掌握细菌基因组的提取方法

实验原理

DNA是一个环形的大分子DNA,真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内 。不同种属的生物
，以及不同形式的细胞（如菌类 、培养细胞
、植物组织，动物组织）基因组提取的方法是不同的 ，但其基本原则是类似的
，即既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含十二烷基硫酸钠（SDS）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质 ，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出
。SDS的作用机理是由于其能结合蛋白
，中和蛋白的电性，使蛋白质的非共价键受到破坏 ，失去二级结构
，从而变形失活，蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在的情况下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应体系中 ，SDS可通过失活蛋白破坏细胞膜 、核膜
，并使组织蛋白与DNA分离；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来 。CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)是一种去污剂 ，可溶解细胞膜
，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（（0.7 mol/L NaCl）是可溶的 ，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时
，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白 ，多糖类物质分开
。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。

实验材料

大肠杆菌DH5α菌液

实验试剂

LB液体培养基
，TE溶液，10%SDS ，蛋白酶K
，5mol/L NaCl， CTAB/NaCl

溶液 ，酚/氯仿/异戊醇
，异丙醇，70%乙醇

实验仪器与用具

微量移液器 ，低温离心机
，水浴锅，eppendorf管 ，恒温摇床

实验步骤

（1）将2mL培养至对数期的大肠杆菌DH5α菌液5000rpm冷冻离心10min弃上清；

（2）加190μL TE悬浮沉淀
，并加10μL 10%SDS，1μL 20mg/mL蛋白酶K ，混匀，37℃保温1h；

（3）加30μL 5mol/L NaCl
，混匀；

（4）加30μL CTAB/NaCl溶液，混匀 ，65℃保温20min；

（5）加入300μL酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）抽提
，5000rpm离心10min，将上清液移至干净离心管；

（6）加入300μL氯仿/异戊醇（24：1）抽提 ，取上清液移至干净管中；

（7）加300μL异丙醇
，颠倒混合，室温下静止10min ，沉淀DNA；

（8）5000rpm离心10min
，沉淀DNA，加入500μL70%乙醇 ，5000rpm离心10min
，弃乙醇，吸干；

（9）溶解于20μLTE ，取3μL 用于琼脂糖凝胶电泳验证，其余-20℃保存 。

实验结果与分析

10 9 8 7 6 M

如图所示
，8号为本组实验结果
。对比maker,第一条带为正常大肠杆菌基因组，中间可以看见模糊的两条带 ，可能为断裂的基因组片段
，下面最亮的为RNA。出现断裂的基因组可能是由于操作过于剧烈 。本组电泳带还比较清晰整齐，其他组不整齐的带可能是电泳技术问题
。RNA含量很大 ，所以出现拖尾现象。

实验二 大肠杆菌感受态细胞的制备及验证

实验目的

1.掌握感受态

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